西亚试剂：Distinct domains of tRNA synthetase recognize the same base

Nature 451, 90-93 (3 January 2008) | doi:10.1038/nature06454; Received 28 August 2007; Accepted 7 November 2007

Distinct domains of tRNA synthetase recognize the same base pair

Kirk Beebe1,2, Marissa Mock1,2, Eve Merriman1 & Paul Schimmel1

Correspondence to: Paul Schimmel1 Correspondence and requests for materials should be addressed to P.S. (Email: schimmel@scripps.edu).

Synthesis of proteins containing errors (mistranslation) is prevented by aminoacyl transfer RNA synthetases through their accurate aminoacylation of cognate tRNAs and their ability to correct occasional errors of aminoacylation by editing reactions1, 2, 3, 4, 5. A principal source of mistranslation comes from mistaking glycine or serine for alanine, which can lead to serious cell and animal pathologies, including neurodegeneration3. A single specific GU base pair (G3U70) marks a tRNA for aminoacylation by alanyl-tRNA synthetase6, 7, 8, 9. Mistranslation occurs when glycine or serine is joined to the G3U70-containing tRNAs, and is prevented by the editing activity that clears the mischarged amino acid. Previously it was assumed that the specificity for recognition of tRNAAla for editing was provided by the same structural determinants as used for aminoacylation. Here we show that the editing site of alanyl-tRNA synthetase, as an artificial recombinant fragment, targets mischarged tRNAAla using a structural motif unrelated to that for aminoacylation so that, remarkably, two motifs (one for aminoacylation and one for editing) in the same enzyme independently can provide determinants for tRNAAla recognition. The structural motif for editing is also found naturally in genome-encoded protein fragments that are widely distributed in evolution10, 11, 12. These also recognize mischarged tRNAAla. Thus, through evolution, three different complexes with the same tRNA can guard against mistaking glycine or serine for alanine.附 蛋白质合成过程详解
 
蛋白质生的合成亦称为翻译（Translation），即把mRNA分子中碱基排列顺序转变为蛋折质或多肽链中的氨基酸排列顺序过程。这也是基因表达的第二步，产生基因产物蛋白质的最后节段。不同的组织细胞具有不同的生理功能，是因为它们表达不同的基因，产生具有特殊功能的蛋白质，参与蛋白质生物合成的成份至少有200种，其主要体第主要由mRNA、tRNA、核糖核蛋白体以及有关的酶和蛋白质因子共同组成。
原核生物与真核生物的蛋白质合成过程中有很多的区别，真核生物此过程更复杂，下面着重介绍原核生物蛋白质合成的过程，并指出真核生物与其不同这处。
蛋白质生物合成可分为五个阶段，氨基酸的活化、多肽链合成的起始、肽链的延长、肽链的终止和释放、蛋白质合成后的加工修饰。
 
一、 氨基酸的活化
在进行合成多肽链之前,必须先经过活化,然后再与其特异的tRNA结合,带到mRNA相应的位置上,这个过程靠氨基酰tRNA合成酶催化,此酶催化特定的氨基酸与特异的tRNA相结合,生成各种氨基酰tRNA。
每种氨基酸都靠其特有合成酶催化,使之和相对应的tRNA结合,在氨基酰tRNA合成酶催化下,利用ATP供能,在氨基酸羧基上进行活化,形成氨基酰-AMP,再与氨基酰tRNA合成酶结合形成三联复合物,此复合物再与特异的tRNA作用,将氨基酰转移到tRNA的氨基酸臂(即3’-末端CCA-OH)上。
 
原核细胞中起始氨基酸活化后，还要甲酰化，形成甲酰蛋氨酸tRNA，由N10甲酰四氢叶酸提供甲酰基。而真核细胞没有此过程。
前面讲过运载同一种氨基酸的一组不同tRNA称为同功tRNA。一组同功tRNA由同一种氨酰基tRNA合成酶催化。氨基酰tRNA合成酶对tRNA和氨基酸两者具有专一性，它对氨基酸的识别特异性很高，而对tRNA识别的特异性较低。
氨基酰tRNA合成酶是如何选择正确的氨基酸和tRNA呢？按照一般原理，酶和底物的正确结合是由二者相嵌的几何形状所决定的，只有适合的氨基酸和适合的tRNA进入合成酶的相应位点，才能合成正确的氨酰基tRNA。现在已经知道合成酶与L形tRNA的内侧面结合，结合点包括接近臂，DHU臂和反密码子臂。
二、 多肽链合成的起始
 
核蛋白体大小亚基，mRNA起始tRNA和起始因子共同参与肽链合成的起始。
真核细胞蛋白质合成起始复合物的形成中需要更多的起始因子参与，因此起始过程也更复杂。
（1）需要特异的起始tRNA即，-tRNAfmet，并且不需要N端甲酰化。已发现的真核起始因子有近10种（eukaryote Initiation factor,eIF） 
（2）起始复合物形成在mRNA5’端AUG上游的帽子结构，（除某些病毒mRNA外）
（3）ATP水解为ADP供给mRNA结合所需要的能量。真核细胞起始复合物的形成过程是：翻译起始也是由eIF-3结合在40S小亚基上而促进80S核糖体解离出60S大亚基开始，同时eIF-2在辅eIF-2作用下，与Met-tRNAfmet及GTP结合，再通过eIF-3及eIF-4C的作用，先结合到40S小亚基，然后再与mRNA结合。
mRNA结合到40S小亚基时，除了eIF-3参加外，还需要eIF-1、eIF-4E及eIF-4G并由ATP小解为ADP及Pi来供能，通过帽结合因子与mRNA的帽结合而转移到小亚基上。但是在mRNA5’端并未发现能与小亚基18SRNA配对的S-D序列。目前认为通过帽结合后，mRNA在小亚基上向下游移动而进行扫描，可使mRNA上的起始密码AUG在Met-tRNAfmet的反密码位置固定下来，进行翻译起始。
 
通过eIF-5的作用，可使结合Met-tRNAfmet·GTP及mRNAR40S小亚基与60S大亚基结合，形成80S复合物。eIF-5具有GTP酶活性，催化GTP水解为GDP及Pi，并有利于其它起始因子从40S小亚基表面脱落，从而有利于40S与60S两个亚基结合起来，最后经eIF-4D激活而成为具有活性的80SMet-tRNAfmet· mRNA起始复合物。
 
三、 多肽链的延长
在多肽链上每增加一个氨基酸都需要经过进位，转肽和移位三个步骤。
1.     进位
为密码子所特定的氨基酸tRNA结合到核蛋白体的A位，称为进位。氨基酰tRNA在进位前需要有三种延长因子的作用，即，热不稳定的EF（Unstable temperature,EF）EF-Tu,热稳定的EF(stable temperature EF,EF-Ts)以及依赖GTP的转位因子。EF-Tu首先与GTP结合，然后再与氨基酰tRNA结合成三元复合物，这样的三元复合物才能进入A位。此时GTP水解成GDP，EF-Tu和GDP与结合在A位上的氨基酰tRNA分离。
 
2.     转肽--肽键的形成（peptide bond formation）
在70S起始复合物形成过程中，核糖核蛋白体的P位上已结合了起始型甲酰蛋氨酸tRNA，当进位后，P位和A位上各结合了一个氨基酰tRNA，两个氨基酸之间在核糖体转肽酶作用下，P位上的氨基酸提供α-COOH基，与A位上的氨基酸的α-NH2形成肽键，从而使P位上的氨基酸连接到A位氨基酸的氨基上，这就是转肽。转肽后，在A位上形成了一个二肽酰tRNA。
3. 移位（Translocation)
转肽作用发生后，氨基酸都位于A位，P位上无负荷氨基酸的tRNA就此脱落，核蛋白体沿着mRNA向3’端方向移动一组密码子，使得原来结合二肽酰tRNA的A位转变成了P位，而A位空出，可以接受下一个新的氨基酰tRNA进入，移位过程需要EF-2，GTP和Mg2+的参加。
以后，肽链上每增加一个氨基酸残基，即重复上述进位，转肽，移位的步骤，直至所需的长度，实验证明mRNA上的信息阅读是从5’端向3’端进行，而肽链的延伸是从氮基端到羧基端。所以多肽链合成的方向是N端到C端。
四、 翻译的终止及多肽链的释放
无论原核生物还是真核生物都有三种终止密码子UAG，UAA和UGA。没有一个tRNA能够与终止密码子作用，而是靠特殊的蛋白质因子促成终止作用。这类蛋白质因子叫做释放因子，原核生物有三种释放因子：RF1，RF2T RF3。RF1识别UAA和UAG，RF2识别UAA和UGA。RF3的作用还不明确。真核生物中只有一种释放因子eRF，它可以识别三种终止密码子。翻译的终止及多肽链的释放过程见左图。
不管原核生物还是真核生物，释放因子都作用于A位点，使转肽酶活性变为水介酶活性，将肽链从结合在核糖体上的tRNA的CCA末凋上水介下来，然后mRNA与核糖体分离，最后一个tRNA脱落，核糖体在IF-3作用下，解离出大、小亚基。解离后的大小亚基又重新参加新的肽链的合成，循环往复，所以多肽链在核糖体上的合成过程又称核糖体循环。

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