西亚试剂：：在质粒载体中进行平末端片段的克隆

在质粒载体中进行平末端片段的克隆

1．分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化1~10μg质粒DNA和外源DNA片段，使它们能产生平末端。

2．苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源DNA片段。

3．分别用TE（pH 8.0）重新溶解纯化出的两种DNA沉淀，使终浓度为100 ng/ml。 假设1 bp相当于660 Da，计算DNA的终浓度（pmol/ml）。

4．将载体DNA去磷酸化。

5．按下表将适量的DNA转移至无菌的0.5 ml离心管：

   

管号
 DNA
 
A和E
 载体1 [60fmol (~100ng)]
 
B
 外源插入片段2[60fmol (~10ng)]
 
C和F
 载体1（60fmol）和外源插入片段3（60fmol）
 
D
 线状载体（5’-磷酸化）（60fmol）
 
G
 环状载体[60fmol (~10ng)]
 

1 载体DNA已进行去磷酸化

2 外源目的DNA可以连接接头。

3 连接反应中，质粒载体和插入的DNA片段摩尔比一般为1：1。DNA的总浓度应约为10ng/μl。

 

a.       A、B和C管中加入：

   10×连接缓冲液      1.0μl

   T4噬菌体连接酶      0.5 Weiss单位

   5 mmol/L ATP        1.0μl

   H2O                  补至8.5μl

   30%PEG 8000          1~1.5μl

b.      D、E和F管中加入：

   10×连接缓冲液      1.0μl

   5 mmol/L ATP         1.0μl

   H2O                  补至8.5μl

   30%PEG 8000          1~1.5μl

   不加DNA酶

 

6．连接反应体系置于16℃水浴温育过夜或20℃水浴温育4 h。

7．用每份稀释的连接产物转化感受态大肠杆菌。转化时，应包括用标准方法制备的已知量的超螺旋质粒DNA作为对照，以检查转化效率。

管号
 DNA
 连接酶（有/无）
 预期转化克隆数
 
A
 载体1
 +
 ~03
 
B
 插入片段
 +
 0
 
C
 载体1和插入片段
 +
 比F管高5倍
 
D
 载体1
 -
 ~0
 
E
 载体2
 -
 比D管高50倍
 
F
 载体和插入片段
 -
 比D管高50倍
 
G
 环状质粒
 -
 2×105
 

1 去磷酸化

2 未去磷酸化

3 如果出现来自去磷酸化的载体DNA自身连接产物的转化子，是由于用碱性磷酸酶处理时未能除尽5’端的磷酸基