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关键词 基因芯片 杂交 检测
随着人类基因组（测序）计划（ Human genome project ）的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得以测定，基因序列数据正在以前所未有的速度迅速增长。然而 , 怎样去研究如此众多基因在生命过程中所担负的功能就成了全世界生命科学工作者共同的课题。为此，建立新型杂交和测序方法以对大量的遗传信息进行高效、快速的检测、分析就显得格外重要了。
基因芯片（又称 DNA 芯片、生物芯片）技术就是顺应这一科学发展要求的产物，它的出现为解决此类问题提供了光辉的前景。该技术系指将大量（通常每平方厘米点阵密度高于 400 ）探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。早在八十年代， Bains W. 等人 [1] 就将短的 DNA 片断固定到支持物上，借助杂交方式进行序列测定。但基因芯片从实验室走向工业化却是直接得益于探针固相原位合成技术和照相平板印刷技术的有机结合以及激光共聚焦显微技术的引入 [2] 。它使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子切实可行，而且借助激光共聚焦显微扫描技术使得可以对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测和分析。正如电子管电路向晶体管电路和集成电路发展是所经历的那样，核酸杂交技术的集成化也已经和正在使分子生物学技术发生着一场革命。现在全世界已有十多家公司专门从事基因芯片的研究和开发工作，且已有较为成型的产品和设备问世。主要代表为美国 Affymetrix 公司。该公司聚集有多位计算机、数学和分子生物学专家，其每年的研究经费在一千万美元以上，且已历时六七年之久，拥有多项专例。产品即将或已有部分投放市场，产生的社会效益和经济效益令人瞻目。
基因芯片技术由于同时将大量探针固定于支持物上，所以可以一次性对样品大量序列进行检测和分析，从而解决了传统核酸印迹杂交（ Southern Blotting 和 Northern Blotting 等）技术操作繁杂、自动化程度低、操作序列数量少、检测效率低等不足。而且，通过设计不同的探针阵列、使用特定的分析方法可使该技术具有多种不同的应用价值，如基因表达谱测定、实变检测、多态性分析、基因组文库作图及杂交测序等。
1 ．基因芯片的主要类型
目前已有多种方法可以将寡核苷酸或短肽固定到固相支持物上。这些方法总体上有两种，即原位合成（ in situ synthesis ）与合成点样两种。支持物有多种如玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等，但需经特殊处理。作原位合成的支持物在聚合反应前要先使其表面衍生出羟基或氨基（视所要固定的分子为核酸或寡肽而定）并与保护基建立共价连接；作点样用的支持物为使其表面带上正电荷以吸附带负电荷的探针分子，通常需包被以氨基硅烷或多聚赖氨酸等。
原位合成法主要为光引导聚合技术（ Light-directed synthesis ），它不仅可用于寡聚核苷酸的合成，也可用于合成寡肽分子。光引导聚合技术是照相平板印刷技术（ photolithography ）与传统的核酸、多肽固相合成技术相结合的产物。半导体技术中曾使用照相平板技术法在半导体硅片上制作微型电子线路。固相合成技术是当前多肽、核酸人工合成中普遍使用的方法，技术成熟且已实现自动化。二者的结合为合成高密度核酸探针及短肽阵列提供了一条快捷的途径。
以合成寡核苷酸探针为例，该技术主要步骤为：首先使支持物羟基化，并用光敏保护基团将其保护起来。每次选取择适当的蔽光膜（ mask ）使需要聚合的部位透光，其它部们不透光。这样，光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基解保护。因为合成所用的单体分子一端按传统固相合成方法活化，另一端受光敏保护基的保护，所以发生偶联的部位反应后仍旧带有光敏保护基团。因此，每次通过控制蔽光膜的图案（透光与不透光）决定哪些区域应被活化，以及所用单体的种类和反应次序就可以实现在待定位点合成大量预定序列寡聚体的目的 [3 ， 4] 。
该方法的主要优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列。例如，合成 48 （ 65536 ） 个探针的 8 聚体寡核苷酸序列仅需 4 × 8=32 步操作， 8 小时就可以完成。而如果用传统方法合成然后点样，那么工作量的巨大将是不可思议的。同时，用该方法合成的探针阵列密度可高达到 106/cm2 。不过，尽管该方法看来比较简单，实际上并非如此。主要原因是，合成反应每步产率比较低，不到 95% 。而通常固相合成反应每步的产率在 99% 以上 [5] 。因此，探针的长度受到了限制。而且由于每步去保护不很彻底，致使杂交信号比较模糊，信噪比降低。为此有人 [6] 将光引导合成技术与半异体工业所用的光敏抗蚀技术相结合，以酸作为去保护剂，使每步产率增加到 98% 。原因是光敏抗蚀剂的解离对照度的依赖是非线性的，当照度达到特定的阈值以上保护剂就会解离。所以，该方法同时也解决了由于蔽光膜透光孔间距离缩小而引起的光衍射问题，有效地提高了聚合点阵的密度。另据报导 [7] ，利用波长更短的物质波如电子射线去除保护可使点阵密度达到 1010/cm2 。
除了光引导原位合成技术外，有的公司如美国 Incyte Pharmaceuticals 等使用压电打印法 (Piezoelectric printing) 进行原位合成。其装置与普通的彩色喷墨打印机并无两样，所用技术也是常规的固相合成方法。做法是将墨盒中的墨汁分别用四种碱基合成试剂所替代，支持物经过包被后，通过计算机控制喷墨打印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等则同于一般的固相原位合成技术。如此类推，可以合成出长度为 40 到 50 个碱基的探针，每步产率也较前述方法为高，可达到 99% 以上。
尽管如此，通常原位合成方法仍然比较复杂，除了在基因芯片研究方面享有盛誉的 Affymetrix 等公司使用该技术合成探针外，其它中小型公司大多使用合成点样法。
后一方法在多聚物的设计方面与前者相似，合成工作用传统的 DNA 或多肽固相合成仪完成，只是合成后用特殊的自动化微量点样装置将其以比较高的密度涂布于硝酸纤维膜、尼龙膜或玻片上。支持物应事先进行特定处理，例如包被以带正电荷的多聚赖酸或氨基硅烷。现在已有比较成型的点样装置出售，如美国 Biodot 公司的点膜产品以及 Cartesian Technologies 公司的 PixSys NQ/PA 系列产品。前者产生的点阵密度可以达到 400/cm2 ，后者则可达到 2500/cm2 。
２．样品的准备及杂交检
