西亚试剂：：样品的准备及杂交检测

目前，由于灵敏度所限，多数方法需要在标记和分析前对样品进行适当程序的扩增，不过也有不少人试图绕过这一问题，如 Mosaic Technologies 公司引入的固相 PCR 方法，引物特异性强，无交叉污染并且省去了液相处理的烦琐； Lynx Therapeutics 公司引入的大规模并行固相克隆法 (Massively parallel solid-phase cloning) ，可在一个样品中同时对数以万计的 DNA 片段进行克隆，且无需单独处理和分离每个克隆。
　　显色和分析测定方法主要为荧光法，其重复性较好，不足的是灵敏度仍较低。目前正在发展的方法有质谱法、化学发光法、光导纤维法等。以荧光法为例，当前主要的检测手段是激光共聚焦显微扫描技术，以便于对高密度探针阵列每个位点的荧光强度进行定量分析。因为探针与样品完全正常配对时所产生的荧光信号强度是具有单个或两个错配碱基探针的 5-35 倍，所以对荧光信号强度精确测定是实现检测特异性的基础 ^[8] 。但荧光法存在的问题是，只要标记的样品结合到探针阵列上后就会发出阳性信号，这种结合是否为正常配对，或正常配对与错配兼而有之，该方法本身并不能提供足够的信息进行分辨。
　　对于以核酸杂交为原理的检测技术，荧光检测法的主要过程为：首先用荧光素标记扩增（也可以有其它放大技术）过的靶序列或样品，然后与芯片上的大量探针进行杂交，将未杂交的分子洗去（如果用实时荧光检测可省去此步 ^[9] ）这时，用落射荧光显微镜或其它荧光显微装置对片基进行扫描，采集每点荧光强度并对其进行分析比较。前已述及，由于正常的 Watson-Crick 配对双链要比具有错配碱基的双链分子具有较高的热力学稳定性。所以，如果探针与样品分子在不位点配对有差异则该位点荧光强度就会有所不同，而且荧光信号的强度还与样品中靶分子的含量呈一定的线性关系。当然，由于检测原理及目的不同，样品及数据的处理也自然有所不同，甚至由于每种方法的优缺点各异以至于分析结果不尽一致。

３．基因芯片技术的主要应用

　　1998 年底美国科学促进会将基因芯片技术列为 1998 年度自然科学领域十大进展之一，足见其在科学史上的意义。现在，基因芯片这一时代的宠儿已被应用到生物科学众多的领域之中。它以其可同时、快速、准确地分析数以千计基因组信息的本领而显示出了巨大的威力。这些应用主要包括基因表达检测、突变检测、基因组多态性分析和基因文库作图以及杂交测序等方面。在基因表达检测的研究上人们已比较成功地对多种生物包括拟南芥（ Arabidopsis thaliana ） ^[10,11] 、酵母 (Saccharomyces cerevisiae)^[12,13] 及人 ^[15,16] 的基因组表达情况进行了研究，并且用该技术（共 157,112 个探针分子）一次性检测了酵母几种不同株间数千个基因表达谱的差异 ^[14] 。实践证明基因芯片技术也可用于核酸突变的检测及基因组多态性的分析，例如对人 BRCA Ⅰ基因外显子 11^[17] 、 CFTR 基因^{［ 22 ］} 、β - 地中海贫血 ^[24] 、酵母突变菌株间 ^[20] 、 HIV-1 逆转录酶及蛋白酶基因（与 Sanger 测序结果一致性达到 98% ） ^[21] 等的突变检测，对人类基因组单核苷酸多态性的鉴定、作图和分型 ^[19] ，人线粒体 16.6kb 基因组多态性的研究 ^[24] 等。将生物传感器与芯片技术相结合，通过改变探针阵列区域的电场强度已经证明可以检测到基因（ ras 等）的单碱基突变 ^[26] 。此外，有人还曾通过确定重叠克隆的次序从而对酵母基因组进行作图 ^[25] 。杂交测序是基因芯片技术的另一重要应用。该测序技术理论上不失为一种高效可行的测序方法，但需通过大量重叠序列探针与目的分子的杂交方可推导出目的核酸分子的序列，所以需要制作大量的探针。基因芯片技术可以比较容易地合成并固定大量核酸分子，所以它的问世无疑为杂交测序提供了实施的可能性，这已为实践所证实 ^[27,28] 。

４．基因芯片技术的研究方向及当前面临的困难

　　尽管基因芯片技术已经取得了长足的发展，得到世人的瞩目，但仍然存在着许多难以解决的问题，例如技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低、重复性差、分析泛围较狭窄等问题。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面。
　　样品制备上，当前多数公司在标记和测定前都要对样品进行一定程度的扩增以便提高检测的灵敏度，但仍有不少人在尝试绕过该问题，这包括 Mosaic Technologies 公司的固相 PCR 扩增体系以及 Lynx Therapeutics 公司提出的大量并行固相克隆方法，两种方法各有优缺点，但目前尚未取得实际应用。
探针的合成与固定比较复杂，特别是对于制作高密度的探针阵列。使用光导聚合技术每步产率不高（ 95% ），难于保证好的聚合效果。应运而生的其它很多方法，如压电打压、微量喷涂等多项技术，虽然技术难度较低方法也比较灵活，但存在的问题是难以形成高密度的探针阵列，所以只能在较小规模上使用。最近我国学者已成功地将分子印章技术应用于探针的原位合成而且取得了比较满意的结果（个人通讯）。
　　目标分子的标记也是一个重要的限速步骤，如何简化或绕过这一步现在仍然是个问题。
　　目标分子与探针的杂交会出现一些问题：首先，由于杂交位于固相表面，所以有一定程度的空间阻碍作用，有必要设法减小这种不利因素的影响。 Southern 曾通过向探针中引入间隔分子而使杂交效率提高于了 150 倍。其次，探针分子的 GC 含量、长度以及浓度等都会对杂交产生一定的影响，因此需要分别进行分析和研究。
　　信号的获取与分析上，当前多数方法使用荧光法进行检测和分析，重复性较好，但灵敏仍然不高。正在发展的方法有多种，如质谱法、化学发光法等。基因芯片上成千上万的寡核苷酸探针由于序列本身有一定程度的重叠因而产生了大量的丰余信息。这一方面可以为样品的检测提供大量的验证机会，但同时，要对如此大量的信息进行解读，目前仍是一个艰巨的技术问题。

５．我国基因芯片的研究现状

　　目前，我国尚未有较成型的基因芯片问世，但据悉已有几家单位组织人力物力从事该技术的研制工作，并且取得了一些可喜的进展。这是一件好事，标志着我国相关学科与技术正在走向成熟。基因芯片技术是一个巨大的产业方向，我们国家的生命科学、计算机科学乃至精密机械科学的工作者们应该也可以在该领域内占有一席之地。但是我们应该充分地认识到，这不是一件轻易的事，不能够蜂拥而至，不能“有条件没有条件都要上”，去从事低水平重复性的研究工作，最终造成大量人力物力的浪费。而应该是有组织、有计划地集中具有一定研究实力的单位和个人进行攻关，这也许更适合于我国国情。

参考文献

１１． Schena M et al. Bioessays 18:427-431
１２． Shalon D et al. Genome Res. 6:639-645
１３． DeRisi JL et al. Science 270:680-686
１４． Winzeler EA et al. Science 281:1194-97(1998)
１５． Schena M et al. Proc.Nat. Acad. Sci. USA 93:10614-10619
１６． DeRisi JL et al. Fed.Am.Soc.Exp.Bio.11:1126
１７． Hacia GH et al. Nat. Genet. 14:441-447
１８． Chee M et al. Science 274(5287):610-14(1996)
１９． Wang D G et al. Science 280(5366):1077-82(1998)
２０． Shoemaker DD et al. Nat. Genet 14:450-456
２１． Kozal MJ et al. Nature Medicine2:753-759
２２． Cronin MT et al. Human Mut.7:244-255
２３． Chee M et al. Science 274:610-613
２４． Drobyshev A et al. Gene 188:45-52(1997)
２５． Sapolsky RJ et al. Genomics 33 ： 445-456
２６． Sosnowski RG et al. Pro. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1119-1123
２７． Michael KL et al. Anal.Chem.1998,70:1242-1248
２８． Pease AC et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91:5022

丙烯醛肉桂醛桂皮醛4-硝基肉桂醛