Lab 的经验和客户的难题

以华联基因体实验室的长期以来承接客户RNA检体的经验来说，我们经常遇到的问题是(1)RNA的总量不够，(2)RNA有严重的盐类污染，(3)RNA有严重的有机溶剂污染，(4)DNA污染及(5)样品降解严重(图一图二)。前四项问题都还好解决，只需要再次萃取或进行纯化即可解决，但是样品降解就较为棘手，常常因重新准备检体一来一往，耗掉不少心力和时间，最后也拿不到好的结果。
客户经常会问为什么执行芯片实验会如此要求RNA质量呢?而其他的检测方法如实时定量聚合连锁反应(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction, Q-PCR) 却不需要?
回答这个问题前就要从实验的原理说起，简单的讲Q-PCR的检测原理是针对要检测的基因，设计一对基因特异性的引子，透过反转录反应(RT)配合PCR的放大方式和及时侦测放大的产物量，藉以回推原始的RNA含量；而RT的方式主要是采用随机引子(Random_primer)、进行互补DNA (cDNA)的翻制，因此即便RNA有些微裂解，作为模板的RNA也可以忠实的被翻制成cDNA。但是芯片实验进行，主要是以放大和讯息RNA(mRNA)完全配对的互补RNA(cRNA) ，再进行杂合反应，此步骤必须利用poly(dT)- T7启动子序列和讯息RNA的poly(A)结合后，将T7启动子序列连带的镶入反转录的cDNA的5端，再经由T7启动子驱动试管内反转录反应，生合成反股的cRNA，再进行后续的芯片杂交的实验。可想而知，如果RNA有降解严重的现象，表示许多mRNA并不能忠实的被放大因此会产生许多伪阴性的结果。至此读者心中可能就有一个概念了，假设Q-PCR和芯片被应用在瞎子摸象的故事情节中，用Q-PCR的人只要能摸到大象的耳朵就可以说这里有大象，透过计算耳朵的数量就可以计算大象的数量；但是用芯片实验方法的人，必须先确认所摸到的个体具备大象的完整特征，才能确确实实的说这里有一只大象。这也就说明了为何芯片实验会如此要求RNA的质量

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